A partir du bouturage
in vitro, on a cherché une méthode permetant d'obtenir un
plus grand nombre de plantes. Les milieux C de Knudson, celui de Murashige
et Skoog (1962), solidifiés avec 1% d'agar-agar ainsi que le milieu
de Vacin & Went (1949) ont été utilisés avec
plus ou moins de succés. Les méthodes employées sont
très variables. Dans certain cas les bourgeons sont mutilés,
soit en les coupant au 2/3 parallélement à la hampe florale
puis obliquement, soit en les fendant en 2, soit en les criblant avec
une aiguille stérilisée. La première et la troisième
méthode donnant les meilleurs résultats. En réaction
à ces traitements, les cals produisent de nombreux bourgeons. Avec
cette méthode encore, les quantités de plantes obtenues
ne sont pas très importantes et des difficultés considérables
ont été rencontrées pour une multiplication de masse.
Ces difficultés sont maintenant résolues par de nombreux
laboratoires.
Un des problèmes
majeurs est la production par les explants de composés phénoliques
toxiques pour les tissus eux-mêmes.Les tissus des Phalaenopsis ont
une concentration élevée en composés phénoliques.
Les méristémes excisés noircissent rapidement, des
produits oxydants de ces phénols diffusent dans le milieu et la
plupart des explants meurent. Plusieurs produits ont été
utilisés pour lutter contre ce phénomène, mais le
procédé le plus efficace consiste à transférer
fréquemment les explants sur des milieux frais (chaque 2 à
3 semaines).
Un protocorme
donne 4 à 20 protocormes tous les 25/35 jours.
Plusieurs méthodes
sont utilisées. Il est possible de partir d'échantillons
prélevés sur les hampes florales, ou sur des feuilles de
plantes cultivées in-vitro où in-vivo.
La multiplication
extensive des tissus est cause de mutations.Certains clones produits in-vitro
ne sont donc pas des reproductions parfaites de la plante originale. La
concentration élevée d'hormones dans les milieux de culture
peut provoquer des changements de couleurs, de formes et de dimensions
des fleurs,ainsi que des malformations diverses sur les plantes. Pour
prévenir ces problèmes, la meilleure méthode consiste
à ne pas chercher à "sur multiplier" à
partir d'un seul prélévement, mais au contraire, à
ne produire que des petites séries. L'origine génétique
des plantes à multiplier joue à ce sujet un grand rôle.
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Le milieu
C de Knudson reste celui qui donne le plus de satisfactions. Il
est additionné de différentes substances dont l'action
n'est pas toujours comprise. Ainsi, le lait de coco induit la prolifération
de protocormes, et la banane sous forme de farine ou fraiche a une
action positive sans que l'on sache exactement pourquoi.
La croissance
des protocormes est bonne sur milieu Hyponex avec 2% de pomme de
terre, 2,5% de banane, 0,01% d'acide citrique, 0,6% de tryptone,
2% de sucrose, 0,8% d'agar et 0,1% de charbon de bois.
La Peptone
est une source d'azote pour la culture d'organismes in-vitro. C'est
un composé riche en acides aminés qui ont une action
positive sur la végétation. Lami (1927) prouve que
les peptones améliorent la germination des Phalaenopsis,
avec des doses de 1 à 2%.
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